2026年1月23日，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院柏林課題組與藥學(xué)院馬明、楊東輝課題組合作在JACS上發(fā)表了題為“Structural Insights into Three Bifunctional Sesterterpene Synthases and Product Profile Investigation by Domain Swapping and Active Site Mutation”的研究論文。該研究通過冷凍電鏡首次揭示了雙功能萜類合酶所具有的一種螺旋管狀結(jié)構(gòu)，并通過酶工程改造產(chǎn)生新的二倍半萜化合物。

萜類化合物已被發(fā)現(xiàn)超過8萬個，具有極大的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性多樣性，然而它們的生物合成卻保守地來源于兩個五碳單元化合物：DMAPP和IPP。這兩個五碳單元化合物主要在兩類酶的催化作用下形成萜類化合物的碳?xì)涔羌埽阂活惷甘钱愇於┺D(zhuǎn)移酶（prenyltransferase, PT）催化一分子的DMAPP和不同數(shù)量的IPP產(chǎn)生鏈狀聚異戊二烯焦磷酸化合物（如10碳單元的GPP、15碳單元的FPP、20碳單元的GGPP、25碳單元的GFPP等）；另一類酶是萜類環(huán)化酶（terpene cyclase, TC）催化不同的聚異戊二烯焦磷酸化合物產(chǎn)生紛繁復(fù)雜的萜類骨架。多數(shù)情況下這兩類酶在自然界獨立存在，然而有一類雙功能萜類合酶同時含有PT和TC（圖1A），可以先由C末端的PT產(chǎn)生聚異戊二烯焦磷酸，再由N末端的TC以聚異戊二烯焦磷酸為底物催化萜類骨架的產(chǎn)生。目前這種雙功能萜類合酶的整體三維結(jié)構(gòu)、底物從PT到TC的傳遞方式正受到越來越多的關(guān)注。

本論文針對尚未解析結(jié)構(gòu)的雙功能二倍半萜合酶開展了研究，選擇了三個雙功能二倍半萜合酶EvAS、EvSS和PbSS作為研究對象。這三個酶的PT功能域催化同樣的反應(yīng)：將一分子DMAPP和四分子IPP轉(zhuǎn)化為GFPP；而它們的TC功能域則以GFPP為底物催化不同的環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)生三個二倍半萜化合物（1–3）（圖1B）。

圖1包含PT和TC的雙功能萜類合酶示意圖（A），以及三個二倍半萜合酶EvAS、EvSS和PbSS的催化功能（B）

研究團(tuán)隊解析了EvAS和PbSS的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)EvAS和PbSS具有類似的結(jié)構(gòu)：兩個PT組成二聚體，而三個這樣的二聚體組成了一個120度旋轉(zhuǎn)對稱軸的六聚體結(jié)構(gòu)，該六聚體中每個PT的活性口袋都朝向中心的孔洞（圖2）；TC由于其位置多變無法觀測到電子密度。這樣的一種PT-六聚體結(jié)構(gòu)和位置多變的TC與已報道的幾個雙功能二萜合酶、雙功能三萜合酶的六聚體結(jié)構(gòu)較為類似，體現(xiàn)了該種結(jié)構(gòu)類型在雙功能萜類合酶中的保守性。

圖2EvAS（A）和PbSS（B）的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。它們均為三個PT二聚體（標(biāo)為a/a', b/b', c/c'）組成的PT-六聚體結(jié)構(gòu)

研究團(tuán)隊進(jìn)而解析了EvSS的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，令人意外的是EvSS雖然也含有類似的PT-六聚體結(jié)構(gòu)，但這些PT-六聚體層層堆積形成一個中空的管狀結(jié)構(gòu)；更有意思的是每一層六聚體相對于下面一層以堆積方向順時針旋轉(zhuǎn)了30度，形成一個螺旋管狀結(jié)構(gòu)（圖3）。每兩層PT-六聚體之間的間隙達(dá)到了75.4 ?（寬度）× 26.7 （高度），這樣大的間隙完全滿足GFPP的傳輸。研究團(tuán)隊又分析了單獨的PT功能域（命名為EvSS-PT）的電鏡結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它呈現(xiàn)同樣的螺旋管狀結(jié)構(gòu)（圖3B）。盡管TC仍然因為位置多變未能觀測到電子密度，但由于TC與PT之間有一段柔性的肽段共價連接在一起，可以合理地推測TC圍繞在PT組成的螺旋管狀結(jié)構(gòu)的側(cè)壁周圍。EvSS這樣的四級結(jié)構(gòu)可能揭示了一種之前未能認(rèn)識到的底物傳遞方式：DMAPP和IPP從兩層PT-六聚體之間的間隙進(jìn)入管狀結(jié)構(gòu)中心空腔，在PT活性中心形成GFPP，然后GFPP再從PT-六聚體之間的間隙流出，被圍繞在螺旋管狀結(jié)構(gòu)周圍的TC捕獲進(jìn)而產(chǎn)生二倍半萜化合物。這樣的一種底物傳遞方式可能更高效，因為它在有限的空間內(nèi)集合了更多的PT和TC參與催化，并且可以更大限度的避免GFPP的泄漏。

圖3EvSS的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（A）（以三層PT-六聚體為例展示，從上到下以灰色、黃色、橙紅色表示，紅色箭頭表示兩層PT-六聚體之間的間隙），以及EvSS和EvSS-PT冷凍電鏡2D分類圖（B）

研究團(tuán)隊還將EvAS、EvSS和PbSS中連接TC和PT的柔性肽段切斷，探討非共價連接的TC和PT在一起催化時對二倍半萜產(chǎn)物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EvSS和PbSS中非共價連接的TC和PT在一起催化時產(chǎn)生與原來全長蛋白（TC和PT共價連接）一樣的產(chǎn)物；然而EvAS中非共價連接的TC和PT（EvAS-TC + EvAS-PT）在一起催化時產(chǎn)生不一樣的產(chǎn)物（化合物4，圖4A），該化合物4為全長EvAS催化產(chǎn)物（化合物1）的生物合成中間體。這樣的結(jié)果提示柔性連接肽段切斷后有可能影響TC 和PT之間的相互作用進(jìn)而影響TC的催化功能。為了探討EvAS-TC特殊的催化功能，研究團(tuán)隊解析了2.05埃分辨率的EvAS-TC晶體結(jié)構(gòu)，它雖然含有I型萜類合酶經(jīng)典的α-螺旋桶狀結(jié)構(gòu)，但其D1-螺旋遠(yuǎn)離原來的位置參與晶格中鄰近分子的相互作用（圖4B），提示D1-螺旋可能在與EvAS-PT相互作用中扮演角色進(jìn)而導(dǎo)致EvAS-TC的催化產(chǎn)物類型發(fā)生改變。

圖4EvAS全長的催化產(chǎn)物與非共價連接EvAS-TC與EvAS-PT催化產(chǎn)物的比較（A），以及EvAS-TC的晶體結(jié)構(gòu)（B）

研究團(tuán)隊還繼續(xù)開展EvAS和EvSS中TC功能域活性位點的定點突變和改造，基于大腸桿菌工程菌的發(fā)酵分離酶的突變體產(chǎn)物，通過波譜學(xué)方法鑒定了9個二倍半萜產(chǎn)物（5–13），其中包括7個新化合物（5–8和11–13）（圖5）。新化合物13為一個含有五元單碳環(huán)的二倍半萜，其骨架類型未在其他二倍半萜化合物中發(fā)現(xiàn)。研究團(tuán)隊推測了所得化合物的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)這些新產(chǎn)物為野生型產(chǎn)物的旁路產(chǎn)物（圖5）。

圖5化合物1，2，4–13的生物合成途徑，其中藍(lán)色背景部分顯示EvAS及其突變體的催化途徑，紅色背景部分顯示EvSS及其突變體的催化途徑，虛線箭頭表示旁路路徑

綜上所述，本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在：（1）首次揭示了雙功能萜類合酶具有的螺旋管狀結(jié)構(gòu)，這種冷凍電鏡四級結(jié)構(gòu)支撐一種PT向TC傳遞底物的嶄新模式；（2）解析了EvAS-TC的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其D1-螺旋可能在與EvAS-PT的相互作用中扮演角色，該螺旋是否在其他雙功能萜類合酶中具有同樣功能值得深入研究；（3）通過酶工程改造產(chǎn)生了7個新的二倍半萜化合物，擴(kuò)展了二倍半萜結(jié)構(gòu)多樣性并展示了酶突變體在新分子創(chuàng)制中的重要作用。

本論文中北京大學(xué)藥學(xué)院碩士生雷陣宇、北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士生呂瑞卿、北京大學(xué)藥學(xué)院碩士生宋文龍為共同第一作者，北京大學(xué)藥學(xué)院馬明教授、楊東輝研究員、北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院柏林研究員為共同通訊作者。感謝天然藥物及仿生藥物全國重點實驗室儀器平臺的賈紅麗/尹富玲（X-射線晶體衍射測試）、李勤/劉芬（核磁共振測試）、陳衛(wèi)（氣相-質(zhì)譜測試）等老師的大力支持！感謝北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部冷凍電鏡平臺的陳丹丹/陳利紅等老師的大力協(xié)助！感謝科技部重點研發(fā)計劃和國家自然科學(xué)基金等項目的支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c17651